Problem z ustaleniem ojcostwa to nie jednorazowe przypadki. W dzisiejszych czasach coraz więcej przyszłych matek nie jest do końca pewna, który mężczyzna, z którym spędzała ostatnio noce jest ojcem. Coraz częściej sprawy te dotyczą młodych kobiet, dopiero wkraczających w dorosłe życie. Obecna technologia pozwala przeprowadzać specjalistyczne testy na ojcostwo dzięki, którym będziemy mogli skutecznie zbadać czy delikwent jest ojcem dziecka czy nie. Dzisiejsza technika pozwala nawet przeprowadzić badanie ojcostwa przed narodzinami dziecka. Dzięki temu ojciec może pomagać matce i wspierać finansowo zanim dojdzie do porodu. Wiadomo przecież, że zanim dziecko się urodzi trzeba zakupić potrzebne artykuły. Często ustalanie ojcostwa dotyczy spraw sądowych, przede wszystkim o chodzi o sprawy dotyczące alimentów. Przyznanie alimentów może być tylko w przypadku jeśli wiadomo kto jest ojcem. Często ojcowie nie przyznają się lub nie ma pewności czy są rodzicem dziecka. W takim przypadku jedynym rozwiązaniem jest przeprowadzenie badań DNA, które pozbawią wątpliwości kto jest ojcem dziecka. Zdarzają się przypadki gdy bliźniaki mają dwóch ojców. Odnotowano jak dotąd 7 takich przypadków, w tym jeden z północnej Polski. Obrazuje to jak nieodpowiedzialni są dzisiejsi dorośli. Są to oczywiście bardzo ekstremalne przypadki ojcostwa, jednak takie rzeczy się zdarzają. Z pewnością gdyby ludzie byli bardziej odpowiedzialni testy na ojcostwo w ogóle nie były by potrzebne.
Coraz bardziej popularne są w naszym kraju profesjonalne testy na ojcostwo. Test taki przeprowadza specjalista w specjalnym laboratorium. Każdy może przeprowadzić taki test, jednak wiąże się to z odpowiednim kosztem. Cena badania ojcostwa waha się w przedziale 700-1500zł. Testy do tanich nie należą, ale przeprowadza się je tylko w szczególnych przypadkach. Dzisiaj mamy w Polsce i przede wszystkim w krajach zachodnich wiele sytuacji, które zmuszają do wykonania badania na ustalanie ojcostwa. Powodem są przede wszystkim częste zdrady małżonków lub wpadki małoletnich dziewcząt, które nie szanują swojego ciała oraz są nieodpowiedzialne i się nie zabezpieczają. Dzisiejsza technologia pozwala bardzo skutecznie wykryć za pomocą specjalistycznych testów DNA pokrewieństwo między ojcem a dzieckiem. W wielu przypadkach takie testy wykonuje się na polecenie sądu. Najczęstsze sprawy sądowe, które wymagają przeprowadzenia takiego testu to sprawy dotyczące przyznania alimentów dla matki oraz sprawy ciąży wywołanej przez gwałt. Często delikwent, który nie stawi się na takie badania zostaje automatycznie winny i ponosi konsekwencje swoich czynów. Oczywiście jeśli okaże się, że osoba która jest podejrzewana o ojcostwo nie okaże się winna nie płaci za taki test. W takim wypadku płaci państwo. W Polsce jest coraz więcej tego typu spraw, najczęściej dotyczą one jednak alimentów. W przypadku, gdy ojciec jest nieletni alimenty będą musieli płacić jego rodzice do czasu aż nie podejmie pracy zarobkowej.
Dzisiejsze czasy to przede wszystkim czasy przepychu i wysokiej konsumpcji. Najważniejszą wartością są pieniądze i wysoka jakość życia. Takie wartości jak rodzina, kultura, religia mają coraz mniejsze znaczenie. Niestety to nie wina przeciętnego Kowalskiego, to świat w jakim przyszło nam żyć narzuca nam takie a nie inne wartości. To właśnie dlatego w dzisiejszych czasach dochodzi do wielu rozwodów, kradzieży, napadów. Coraz częściej ojcowie porzucają swoje rodziny lub też w ogóle nie przyznają się do ojcostwa. Bardzo często w takim przypadku matki nie mają wyjścia i muszą wyjść na drogę sądową. Na polecenie sądu potencjalny ojciec dziecka musi stawić się na badania ojcostwa – jest to jedyny sposób by dowiedzieć się, czy człowiek, który jest podejrzewany o ojcostwo faktycznie tym ojcem jest. Badania typu ustalanie ojcostwa są bardzo popularne w ostatnich latach. Zdarzają się naprawdę różne historie w dzisiejszym świece i takie badanie pomaga rozwikłać wiele spraw. Przede wszystkim jeśli ojciec nie chce wychowywać swojego dziecka jest zobowiązany do płacenia alimentów, do czasu aż dziecko ukończy szkołę lub też do 18 roku życia w przypadku dzieci, które nie podejmują nauki. Dzisiejsze testy na ojcostwo są bardzo skuteczne, ich skuteczność dochodzi do blisko stu procent. Są to badania kosztowne, ponieważ wykonują je zazwyczaj prywatne lub państwowe laboratoria genetyczne, a takie testy nie są refundowane przez państwo. Przeciętny koszt wykonania badania na ojcostwo wynosi około 1000zł.
W dzisiejszych czasach w wielu rodzinach pojawiają się różne problemy. Często dotyczą one niestety dzieci. Coraz częściej w polskich małżeństwach dochodzi do nieporozumień związanych ze zdradą. Problem dotyczy zarówno mężczyzn jak i kobiet. W większości przypadków zdrady w małżeństwach nie wychodzą na jaw, jednak niektóre okoliczności wyjawiają ekscesy jednego z małżonków. Taką okolicznością jest na przykład ciąża – w przypadku mężczyzny mam na myśli ciąża kochanki, w przypadku kobiety ciąża z innym mężczyzną. W takich przypadkach nie tylko pojawia się problem z zaufaniem i wątek nie kończy się tylko rozwodem, chodzi przecież o wychowywanie nowego potomka. O ile mamy do czynienia ze zdradą z jednym partnerem o tyle zdrada z kilkoma partnerami rodzi kolejne problemy. W takich wypadkach chodzi przede wszystkim o ustalania ojcostwa które wyjaśnią na kim spoczywa obowiązek wychowywania. Dzisiejsze testy na ojcostwo są bardzo dokładne. W 99,9% przeprowadzone badanie ojcostwa jest prawdziwe. Oznacza to, że tylko naprawdę malutki ułamek badań kończy się błędnym wynikiem. Dzisiejsza technologia i laboratoria genetyczne dają prawie 100-procentową skuteczność badań na ojcostwo. Badanie takie jest oczywiście płatne i do tanich nie należy. Średnia cena jednego badania wynosi około 1000zł. Aby takie badanie można było przeprowadzić oboje potencjalnych rodziców musi na nie wyrazić zgodę. W szczególnych przypadkach badanie wykonuje się na polecenie sądu. Jest to możliwe tylko w przypadku posiadania dowodów, które miałyby sugerować, że pozwany jest ojcem, lub też w sprawie gwałtu.
Czasy w jakich przyszło nam żyć, pomimo bardzo wysokiej konsumpcji są bardzo trudne. Żyjemy w ciągłym stresie przez co bardzo często podejmujemy pochopne decyzje, które w przyszłości mogą się odbić bardzo negatywnie. Często jesteśmy bardzo lekkomyślni i nie stosujemy się do zasady, którą wpajali nam nasi rodzice „Pomyśl dwa razy zanim coś zrobisz”. Częściej w sytuacjach z jakimi się zderzamy bardziej pasuje stwierdzenie „Polak mądry po szkodzie”. O ile osoby starsze, bardziej doświadczone jako tako potrafią sobie radzić w dzisiejszym świecie (nie wszyscy, ale jednak) o tyle młode, dopiero wchodzące w dorosłe życie popełniają masę błędów i co jest przerażające, coraz coraz więcej pojawia się w naszym społeczeństwie rodziców-nastolatków. O ile wpadka młodej pary jest czymś zupełnie zrozumiałą o tyle sytuacja młodych dziewcząt, używających na każdej imprezie i zachodzących w ciążę jest przypadkiem wybitnie ekstremalnym i przygnębiającym. Co zrobić gdy nie jesteśmy pewni kto jest ojcem poczętego dziecka? Dzisiaj nie ma najmniejszych problemów jeśli chodzi o ustalania ojcostwa. Dzisiejsza technika pozwala na dokładne testy DNA, jednak aby je wykonać trzeba nakłonić potencjalnych tatusiów do tego aby się stawili na takie badania ojcostwa – bez ich próbek DNA ustalenie ojcostwa będzie niemożliwe. W przypadku gdy potencjalny ojciec nie chce się stawić na takie badanie trzeba wystąpić na drogę sądową. Badanie takie jest oczywiście płatne, za każde badanie możemy zapłacić od 800 do nawet 2000 zł, wszystko zależy od ilości pobranych próbek i od samego laboratorium. Badanie takie jest skuteczne aż w 99,90% przypadków.
Reakcja PCR składa się z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodzą w rożnych temperaturach. Można zatem wymuszać je bez ingerencji w skład mieszaniny, a jedynie przez zmianę temperatury mieszaniny reakcyjnej.
- Denaturacja. Pierwszym etapem jest rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA (lub mRNA, jeśli stanowi matrycę). W wysokiej temperaturze (zwykle około 95 °C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W celu uzyskania tego efektu podnosi się temperaturę mieszaniny reakcyjnej do wymaganych 95° na 15 sekund.
- Annealing – hybrydyzacja odcinków starterowych. Polega na tworzeniu odcinków dwuniciowych, składających się z przygotowanych starterów – cząsteczek DNA komplementarnych do sekwencji DNA oskrzydlających gen mający ulec namnożeniu – z matrycową cząsteczką DNA. Etap ten zachodzi w temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-60 °C), przyłączają się one do matrycy. Ponieważ roztwory primerów są dodawane w dużym nadmiarze w stosunku do matrycy, jest bardzo mało prawdopodobne, żeby na tym etapie, zamiast hybryd starter-matryca utworzyły się hybrydy połączonych się ze sobą dwóch nici matrycy.
- Elongacja – Na tym etapie zachodzi właściwa synteza DNA i tym samym amplifikacja pożądanego genu. Podwyższenie temperatury do około 72 °C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy. Reakcja ta trwa zwykle 30 sekund.
Następnie cykl powtarza się i w kolejnym etapie annealingu i elongacji jako matryca mogą służyć wszystkie zsyntetyzowane dotychczas cząsteczki genu. W ten sposób reakcja, dopóki substraty i enzym są w wystarczającej ilości, zachodzi coraz szybciej, powodując coraz większy przyrost kopii genu na etapie elongacji.
Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2n cząsteczek. W praktyce wydajność procesu jest mniejsza, co nie zmienia faktu, że metoda PCR pozwala na geometryczne zwielokrotnienie pożądanego łańcucha DNA. Konwencjonalna technika PCR pozwala na namnażanie łańcuchów DNA o maksymalnej długości ok. 10 kpz.
Sekwencjonowanie DNA – technika odczytywania sekwencji, czyli kolejności par nukleotydowych w cząsteczce DNA.
Sekwencjonowanie dokonuje się przy pomocy zautomatyzowanych sekwencjonatorów. Manualne sekwencjonowanie stosuje się przy opracowywaniu nowatorskich metod, w niektórych laboratoriach dla krótkich fragmentów, lub podczas ćwiczeń.
- Przykład sekwencji DNA (początek operonu laktozowege E. coli z GenBank):
GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGG
- gdzie: A – adenina; C – cytozyna; G – guanina; T – tymina
Metody historyczne
Historyczną już i wypieraną metodą jest opracowana w 1981[1]- r metoda Sangera, oparta o syntezę DNA przez polimerazę DNA in vitro. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksynukleotydów (ddNTP), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dalsze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym nukleotydem. Produkty reakcji rozdziela się elektroforetycznie, co powoduję ich segregację pod względem wielkości.
Metody współczesne
Obecnie metoda odczytu została zautomatyzowana dzięki wykorzystaniu znakowanych fluorescencyjnie trifosforanów dideoksynukleotydów i pozwala na odczyt 300-1000 par zasad z jednej kapilary lub linii nażelu.
Autorem alternatywnej metody sekwencjonowania DNA, z wykorzystaniem specyficznej, chemicznej degradacji DNA, byli Walter Gilbert i Allan Maxam (metoda Maxama-Gilberta)[2]. Gilbert wraz z Frederickiem Sangerem otrzymali za to osiągnięcie nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana.
Nowoczesne masowo równoległe aparaty do sekwencjonowania DNA są w stanie pracować z szybkością rzędu milionów par zasad na godzinę. Tranzystory polowe DNA umożliwiają użycie natywnego DNA w hybrydyzacji do mikromacierzy i odczyt w czasie rzeczywistym.
Nagroda Archon Genomics X PRIZE w wysokości 10 mln dolarów czeka na ośrodek, który będzie w stanie zsekwencjonować 100 genomów ludzkich w ciągu 10 dni[3]. Pierwsze sekwencjonowanie genomu człowieka zajęło wiele lat (zob. Projekt poznania ludzkiego genomu).
Nowoczesne metody sekwencjonowania DNA są na tyle tanie, iż setki tysięcy osób zapłaciły za zbadanie swojego DNA i wzięły udział w Projekcie Genograficznym. Ta względna taniość umożliwiła również rozwój m.in. genetyki genealogicznej oraz wielu rodzajów badań testujących obecność mutacji.
Metody rozwojowe
- PCR
- Metodą bąbelkową + pyrosekwencjonowanie
- 454 sequencing pozwala 300 MBp na dzień w jednej maszynie [1]. Metoda ta jest szczególnie przydatna do sekwencjonowania aDNA.
- bezpośredniego odczytu:
- nanosekwencjonowanie. Przesuwająca się cząsteczka DNA poprzez centrum aktywne modyfikowanych polimeraz jest odczytywana bezpośrednio. Szybkość takiego odczytu może dochodzić od 300 Bp/s dla pojedynczego nanometrowego czujnika[4].
- mikroskopowe
- 1953 – opracowanie modelu podwójnej helisy DNA przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka
- 1972 – opracowanie sposobów izolacji materiału do dalszych badań. Rozwój technologii rekombinacji umożliwiający izolację dowolnych fragmentów DNA i ich replikację.
- 1977 – Allan Maxam i Walter Gilbert ogłaszają publikację pt. Sekwencjonowanie DNA przez chemiczną degradację. W tym samym czasie Sanger opublikował też metodę sekwencjonowania DNA przez syntezę katalizowaną enzymatycznie.
- 1980 – Fred Sanger i Walter Gilbert otrzymali nagrodę Nobla
- 1982 – utworzono Genbank – publicznie dostępną bazę danych sekwencji DNA
- Andre Marion i Samuel Eletr utworzyli firmę Applied Biosystems, która w tym okresie zdominowała automatyczne sekwencjonowanie DNA
- 1982 – Akiyoshi Wada zbudował roboty sekwencyjne dla firmy Hitachi.
- 1984 – badacze z MRC odczytali kompletną sekwencję wirusa Epstein-Barr, 170 kb.
- 1997 – zsekwencjonowano 5Mb genom bakterii Escherichia coli.
- 2001, 15 lutego – Konsorcjum HUGO opublikowało sekwencję genomu ludzkiego w Nature.
- 2001, 16 lutego – firma Celera Genomics opublikowała sekwencję genomu ludzkiego w Science.